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浅谈流式细胞仪的事情原理和应用

【摘要】 泉源:雪球App,作者: 基因谷,(https://xueqiu.com/1912517390/134234890) 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七......

泉源:雪球App,作者: 基因谷,(https://xueqiu.com/1912517390/134234890)

流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代生长起来的一项高科学手艺,80年代最先从基础研究生长到临床医学研究及疾病的诊断和治疗监测,我国在80年代初引进了第一台流式细胞仪。

它集光学、电子学、流体力学、细胞化学、生物学、免疫学以及激光和计算机等多门学科和手艺于一体, 同时具有剖析和分选细胞功效,对细胞悬液举行快速剖析,通过对流动液体中排列成单列的细胞举行逐个检测,获得该细胞的光散射和荧光指标。

它不仅可丈量细胞巨细、内部颗粒的性状,还可检测细胞外面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平举行剖析, 在短时间内检测剖析大量细胞,并网络、储存和处置数据,举行多参数定量剖析; 能够分类网络(分选)某一亚群细胞,分选纯度>95%。

在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科普遍应用。具有检测速度快、丈量指标多、采集数据量大、剖析周全、方式天真等特点。

海内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产: Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)和BECKMAN- COULTER公司。它们生产出一系列科研型和临床型的流式细胞仪,并研制生产了FCM所用的种种单克隆抗体和荧光试剂。

科研型流式细胞仪(如FACStar, FACSort, EPICS-Elite等)功效齐全,剖析天真,但操作对照繁琐,必须由经由正规培训的专业手艺人员举行操作。临床型的仪器(FACScan, Profile等)易于操作,稳定性好,剖析速度快,适合在临床实验室中应用。

随着该仪器性能的不停完善,操作简朴的各新型流式细胞仪相继问世。新试剂的不停发现使试验用度日益降低,FCM也从研究室逐步进入临床实验室,成为通例实验诊断的主要手段,不仅为临床提供了主要的诊断依据,也使磨练科室的诊断水平、实验手艺提高到一个新的高度。 

流式细胞仪事情原理

流式细胞仪的事情原理是:将待测细胞经特异性荧光染料染色后放入样品管中,在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出,形成细胞柱。

流式细胞仪通常以激光作为发光源。经由聚焦整形后的光束,垂直照射在样品流上,被荧光染色的细胞在激光束的照射下,发生散射光和引发荧光。

这两种信号同时被前向光电二极管和90°偏向的光电倍增管吸收。光散射信号在前向小角度举行检测,这种信号基本上反映了细胞体积的巨细;荧光信号的接受偏向与激光束垂直,经由一系列双色性反射镜和带通滤光片的星散,形成多个差别波长的荧光信号。

这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜外面抗原的强度或其核内物质的浓度,经光电倍增管吸收后可转换为电信号,再通过模/数转换器,将延续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。

计算机把所丈量到的种种信号举行计算机处置,将剖析效果显示在计算机屏幕上,也可以打印出来,还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步剖析。

检测数据的显示视丈量参数的差别由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达,其X轴为丈量强度,Y轴为细胞数目。

一般来说,流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数,这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据,既可以单独显示每个参数的直方图,也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。

细胞的分选是通过星散含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体,充电后振动,使喷出的液流断裂为平均的液滴,待测定细胞就涣散在这些液滴之中。

将这些液滴充以正负差别的电荷,当液滴流经带有几千伏特的偏转板时,在高压电场的作用下偏转,落入各自的网络容器中,不予充电的液滴落入中心的废液容器,从而实现细胞的星散。对分选出的细胞可以举行培育或其它处置,做更深的研究。

流式细胞术的临床应用

随着对FCM研究的日益深入,其价值已经从科学研究走入了临床应用阶段,在我国临床医学领域里已有着普遍的应用。

1

在临床细胞免疫中的作用

FCM通过荧光抗原抗体检测手艺对细胞外面抗原剖析,举行细胞分类和亚群剖析。这一手艺对于人体细胞免疫功效的评估以及种种血液病及肿瘤的诊断和治疗有主要作用。有大量文章先容了淋巴细胞亚群等在种种疾病中的转变。

正常人群淋巴细胞T4/T8比值大约为2∶1,但在人体细胞免疫力低下时可泛起比例倒置。用FCM还可以监测肾移植后病人的肾排挤反映,若是T4/T8比例倒置,病人预后优越,较少发生肾排异征象;反之排异危险性增添。

同样此种测定手艺也用于爱滋病的诊断和治疗中。另有作者报告了外周血淋巴细胞免疫表型的参考值,并对其种族、性别、岁数等影响因素举行了探讨。

2

在血液病诊断和治疗中的应用

FCM通过对外周血细胞或骨髓细胞外面抗原和DNA的检测剖析,对种种血液病的诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用。

(1)白血病的诊断和治疗:

FCM接纳种种抗血细胞外面分化抗原(CD)的单克隆抗体,借助于种种荧光染料(异硫氰基荧光素FITC,藻红卵白PE等)测定一个细胞的多种参数,以正确地判断出该细胞的属性。

种种血细胞系统都具有其怪异的抗原,当形态学检查难以区别时,免疫表型参数对种种急性白血病的诊断和判别诊断有决定性作用。例如干细胞表达CD34,髓系表达CD13、CD14,B细胞系表达CD10、CD19、CD20等,T细胞系表达CD2、CD3、CD5、CD7,行使FCM可以测定出血细胞表达种种抗原的水平,协助临床确诊。

同其它肿瘤的治疗一样,测定DNA倍体和举行细胞周期剖析对指导白血病化疗有一定作用,差别的白血病患者或统一患者在差别病期白血病细胞增殖状态差别,定期领会细胞增殖情形接纳响应药物可以提高疗效。 

现在临床除化疗药物治疗外还接纳造血干细胞移植手艺治疗急性白血病和一些疑难性疾病。FCM通过对人白细胞抗原(HLA)配型的测定可以为异体干细胞移植病人选择出最合适的供体。造血干细胞移植手艺主要包罗干细胞的判别、活性测定、干细胞发动和采集、星散纯化、保留扩增、肿瘤细胞的净化、干细胞回输以及术后保持移植物抗宿主病的低发生率等一系列历程。

FCM测定CD34、HLA-DR、CD33等细胞外面标志物,成为干细胞移植手艺主要的监测手段。用FCM检测一系列指标考察病人的恢复状态,可以对预后做出早期的判断。

(2)网织红细胞的测定及临床应用:

网织红细胞计数是反映骨髓造血功效的主要指标,FCM通过某些荧光染料(吖啶橙、噻唑橙等)与红细胞中RNA连系,定量测定网织红细胞中RNA,获得网织红细胞占成熟红细胞的百分比。

此外FCM还可以丈量出网织红细胞的成熟度,对红细胞增殖能力的判断很有意义。为干细胞移植术后恢复的判断、血虚的治疗监测、肿瘤病人放化疗对骨髓的抑制状态等提供了依据。

(3)其它种类血液病的诊断和治疗监测:

阵发性睡眠性血红卵白尿症是一种造血干细胞克隆病,细胞CD55、CD59抗原表达减低是该病的一个特点。该抗原属于血细胞外面磷脂酰肌醇锚连卵白家族,是主要的补体调治卵白,它通过与补体C8、C9的连系以阻止补体膜攻击复合物的形成,从而抑制细胞被补体激活消融。

FCM接纳荧光符号的单克隆抗体对血细胞CD59的表达做定量剖析,可以协助临床做出诊断并判断疾病的严重水平。

3

在肿瘤学中的应用

这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、涣散制备成单细胞悬液,用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量举行剖析,将不易区分的群体细胞分成三个亚群(G1期,S期和G2期),DNA含量直接代表细胞的倍体状态,非倍体细胞与肿瘤恶性水平有关。

(1)发现癌前病变,协助肿瘤早期诊断:人体正常的体细胞均具有对照稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时,在其发生、生长历程中可随同细胞DNA含量的异常改变,FCM可正确定量DNA含量的改变,作为诊断癌前病变生长至癌变中的一个有价值的标志,能对癌前病变的性子及生长趋势作出估价,有助于癌变的早期诊断。

(2)在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用:FCM在肿瘤诊断中的主要作用已经被认可,DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据,FCM剖析病理细胞具有速度快、信息量大,敏感度高等优点,已被用在通例事情中。肿瘤细胞DNA倍体剖析对病人预后的判断有主要作用,异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高,而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。

FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量举行剖析,还可凭据化疗历程中肿瘤DNA漫衍直方图的转变去评估疗效,领会细胞动力学转变。临床医师可以凭据细胞周期各时相的漫衍情形,依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论,设计最佳的治疗方案。

4

在血栓与出血性疾病中的应用

(1)血小板功效的测定:正常情形下血小板以涣散状态在血管内运行,但当血管损伤、血流改变或受到化学物质刺激时血小板被活化而发生一系列改变。由于血小板的活化水平可由血小板膜糖卵白表达水平的崎岖来判断,FCM测定血小板膜糖卵白的表达情形成为检查血小板功效的一种新手段。

该方式敏捷、特异性高。若是接纳全血法测定,只需微量标本,适合于儿童及血小板削减性疾病的患者。

血小板活化时其质膜糖卵白较其静止期发生显著改变,FCM可以通过单抗免疫荧光符号(血小板膜糖卵白Ⅱb/Ⅲa,CD62,CD63等)监测血小板功效及活化情形,有利于血栓栓塞性疾病的诊断和治疗。

此外血小板活化时其细胞内的钙离子浓度发生很大转变,借助于钙离子敏感荧光探针的辅助,用FCM测定钙离子浓度,可以作为活化血小板监测的非免疫性指标。

(2)血小板相关抗体的测定:免疫性血小板削减性紫癜病人血浆中可发生血小板自身抗体,连系在血小板外面,称为血小板相关抗体,其分子可以是IgG、IgA或IgM,用羊抗人IgG、IgA、IgM荧光抗体符号被测血小板,FCM可以测定血小板相关抗体含量。

直接法检测血小板外面的相关抗体,间接法可测定血清中的相关抗体。该方式用于该病的诊断及治疗监测,具有检测速度快、敏捷度高的优点。

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